Ass. A. SANTA MARIA O.N.L.U.S
LESIONI TRAUMATICHE DEL MIDOLLO SPINALE
PROGRAMMA DI RICERCA
PRESENTATO DA ALFREDO GORIO A GIUSEPPE SENALDI
Gli obiettivi del progetto spaziano da un approfondimento delle conoscenze attuali sui meccanismi fisiopatologici attivati dalla lesione traumatica del midollo spinale all'identificazione di nuove prospettive di trattamento farmacologico per mezzo delle conoscenze sia già a nostra disposizione che da quelle eventualmente acquisibili attraverso l'attuazione del presente progetto di ricerca. Attualmente non è a disposizione dei pazienti e delle autorità sanitarie alcuna forma di trattamento terapeutico che sia almeno in grado di contenere in limiti più sopportabili i profondi disagi fisici e psicologici a cui vanno incontro il paziente affetto dalla lesione spinale e la cerchia delle persone a lui più vicine. Non ultimo il problema ricopre una notevole rilevanza economica a livello personale per chi è coinvolto direttamente e per lo stato che fornisce l'assistenza socio-sanitaria. Quest'ultimo problema viene presentato nell'introduzione al progetto scientifico. Il relatore del progetto ritiene infatti che questi presupposti costituiscano il collante e la motivazione costante che dovrebbero spingere la ricerca medico-scientifica e le altre strutture dello stato alla ricerca della soluzione o almeno ad una attenuazione della gravità di questo problema che colpisce prevalentemente persone in giovane età. La situazione attuale è tale che persone colpite anche in forma grave da para- o tetraplegia conseguente a trauma spinale possono sopravvivere tutta una vita grazie a cure palliative, mentre noi non siano in grado di fornire loro una terapia che porti al ripristino delle funzioni perse.
CONSEGUENZE PSICOLOGICHE, SOCIALI ED ECONOMICHE DELLE LESIONI SPINALI
Le lesioni al midollo spinale rappresentano un grave problema sia per gli individui colpiti che per la società in generale. In aggiunta al dolore ed all'angoscia personale, le persone colpite da questa lesione devono anche affrontare l'impatto immediato ed a lungo termine di questa lesione sulle loro attività e i sui loro progetti di vita. Le risorse finanziarie disponibili devono essere trasferite ad altri usi per sostenere i trattamenti riabilitativi e la salute delle persone affette. Simultaneamente, però, la menomazione ha portato ad una riduzione temporanea o permanente dei guadagni.
La lesione spinale provoca dei profondi cambiamenti nella vita di quelli che la subiscono ma anche nella vita delle loro rispettive famiglie. Questi cambiamenti comprendono sia gli aspetti economici riguardanti anche le modalità di spesa, che ora devono essere dirette a sostenere gli ingenti costi medici e della riabilitazione, sia aspetti riorganizzativi della vita lavorativa e del tempo libero, che devono tenere conto della nuova situazione. In breve, questo tipo di lesione provoca dei drastici cambiamenti presenti e futuri sulle condizioni economiche e sullo stile di vita della persona colpita e della sua famiglia.
Il danno psicologico è difficilmente quantificabile, ma sicuramente rilevante. Le persone colpite da trauma spinale si trovano improvvisamente oppresse dall'impegno psicologico ed emotivo di adattare tutto il proprio stile di vita alla nuova condizione legata alle limitazioni fisiche imposte loro dalla lesione spinale. La limitazione nell'attività fisica e la dipendenza dagli altri per le attività quotidiane può portare a depressione, perdita di stima verso se stessi, risentimenti e molti altri problemi emotivi. Questi effetti psicologici si riflettono comunemente su familiari, parenti e persone vicine in genere, che ora devono ridefinire il loro ruolo in modo da affrontare la nuova situazione in modo adeguato. La moglie (i traumatizzati sono principalmente di sesso maschile) potrebbe lasciare il lavoro per accudire al marito, e se lo facesse parzialmente altre persone verrebbero coinvolte ingrandendo il problema. L'utilizzo diverso delle risorse finanziarie e del tempo libero della famiglia provoca gravi cambiamenti nello stile di vita e può causare situazioni di grave stress nei vari componenti della famiglia.
Quante e chi sono le persone colpite da lesioni spinali ?
Questi dati si riferiscono purtroppo soltanto agli USA, dove i dati epidemiologici sulle lesioni spinali vengono raccolti e sono a disposizione del pubblico. Vengono riscontrati 721 casi di lesioni spinali ogni milione di persone. Per il 71% sono di sesso maschile ed il 62.4% è di età compresa tra i 15 e 29 anni. Quelli al di sopra dei 45 anni costituiscono soltanto il 19,5%. Le lesioni traumatiche derivano da incidenti automobilistici e motociclistici per più del 50%, mentre lo sport incide per circa il 15%. La prevenzione degli incidenti automobilistici ridurrebbe drasticamente il numero di lesioni spinali.
Vita e lavoro. La lesione spinale ha delle conseguenze catastrofiche, la maggior parte delle persone lascia il lavoro. Quelli che prima dell'incidente svolgevano funzioni dirigenziali od erano impegnati in lavori di concetto hanno poi mantenuto lo stesso tipo di attività per il 50% dei casi, mentre quelli che erano impegnati in lavori manuali o nel trasporto o hanno mantenuto solo nel 4% dei casi. Inoltre è ridotto drasticamente anche il tempo dedicato alle attività lavorative ed agli amici, alla famiglia ed alle relazioni sociali in genere.
Costi. Vengono intesi quei costi nei quali incorre la persona come diretto risultato della lesione spinale e che non si sarebbero verificati altrimenti. Spese aggiuntive per le cure mediche (Ospedalizzazioni in Italia ed all'estero, specialisti, etc.), per apparecchiature speciali dedicate al recupero dei movimenti, per la terapia riabilitativa e psicologica (etc.), per la modificazione degli ambienti dove vive, per eventuali persone che assistono.
Conseguenze economiche. Le conseguenze economiche sono direttamente collegate al numero delle persone colpite ed alla gravità della lesione spinale, ed a come queste persone siano riuscite ad adeguarsi a questa nuova situazione. Questi dati risalgono a oltre dieci anni fa e provengono dall'organizzazione dei Paralyzed Veterans of America (PVA), quindi l'entità dei costi ed il loro carico di distribuzione è tipico degli Stati Uniti ma sono riconducibili al nostro paese. Il costo medio dell'ospedalizzazione è di circa 100.000 $ ai quali va aggiunta una spesa annua di 14.000$ che senza lesione spinale non si incontrerebbe. I mancati guadagni, conseguenti a minori prestazioni, sono riconducibili a circa 13.000$. Nel 1988 i costi diretti provocati dalle lesioni spinali ammontavano a 3,4 Miliardi di dollari e quelli indiretti a 2,2 per un costo totale per il paese di 5,6 Miliardi di dollari USA. Nel caso di un giovane che subisse la lesione spinale a 27 anni, il costo complessivo si aggira intorno ad 1 milione di dollari USA. La prevenzione e la cura delle lesioni spinali non solo costituiscono un importantissimo obbiettivo medico-scientifico ma rappresenterebbero anche un enorme risparmio per la società.
INTRODUZIONE ALLA FISIOPATOLOGIA DELLA LESIONE SPINALE
Ai neuropatologi è noto che l'esame istologico del midollo spinale di pazienti, morti acutamente in seguito a trauma e che nello stesso incidente abbiano subito anche un grave trauma spinale, non rivela gravi alterazioni patologiche. Queste alterazioni cominciano ad essere evidenti 24 ore dopo, vi è quindi una certa latenza tra l'impatto e la necrosi del tessuto nervoso. Questa semplice osservazione suggerisce l'esistenza di un certo intervallo di tempo nel quale è assolutamente necessario che inizino gli interventi farmacologici mirato al contenimento del danno scatenato dal trauma spinale. Questo quadro degenerativo può essere riprodotto nei laboratori utilizzando dei modelli sperimentali di lesioni spinali.
In condizioni sperimentali controllate è possibile osservare che alcuni eventi si manifestano rapidamente entro poche decine di minuti, e potrebbero essere considerati come i componenti della lesione primaria anche se alcuni di essi sono certamente implicati nella progressione del danno e quindi alla base anche dei cambiamenti secondari. La paraplegia e la perdita della conduzione del segnale elettrico sono le principali alterazioni che vengono osservate istantaneamente dopo la lesione traumatica del midollo spinale. Gli studi effettuati hanno rilevato che immediatamente dopo la lesione si verifica una profonda alterazione delle membrane cellulari con gravi cambiamenti di elettroliti nel sito di lesione, questo spiega il rapido blocco dell'eccitabilità. Queste alterazioni di membrana vengono accompagnate o immediatamente precedute dal danneggiamento fisico dei vasi con alterazione della permeabilità della barriera emato-spinale ed emorragia petecchiale con conseguente ischemia e progressiva trombosi ed edema spinale che aumenta in maniera molto marcata e parallelamente alla necrosi.
Il danno provocato dalla lesione traumatica del midollo spinale deriva quindi sia dalla componente di distruzione tissutale causata direttamente dall'impatto meccanico nell'incidente che dalla seconda componente tardiva che come descritto sopra ha le stesse caratteristiche dell'insulto ischemico. In effetti le alterazioni ioniche e biochimiche che si osservano in questa fase sono :
1. accumulo tissutale di calcio, alterazione dell'eccitabilità
2. trombosi progressive
3. edema ed emorragia
4. aumento della formazione di radicali liberi
5. aumento della liberazione degli aminoacidi eccitatori
6. aumento della poli- e mono-ADP-ribosilazione proteica
7. attivazione di proteasi e fosfolipasi con degradazione cellulare
8. apoptosi neuronale e degli oligodendrociti alla periferia della lesione
Quest'ultima condizione è particolarmente importante perché può portare alla demielinizzazione permanente con conseguente blocco della conduzione nervosa midollare.
Dal punto di vista isto-patologico le lesioni traumatiche del midollo spinale sono per oltre l'80% incomplete, in esse si osserva la più o meno completa distruzione della sostanza grigia con la frequente preservazione strutturale degli assoni costituenti le vie mieliniche discendenti della parte ventrale del midollo. Purtroppo gli assoni sopravvissuti sono ineccitabili probabilmente a causa della demielinizzazione, dell'alterata composizione ionica dei fluidi costituenti il milieu extracellulare ed anche di alterazioni assonali dirette causate dall'insulto ischemico. Quest'ultimo punto è stato recentemente aggredito terapeuticamente con la 4-aminopiridina (4-AP), che è stata impiegata in due studi clinici condotti negli USA. Questo farmaco è un bloccante dei canali del potassio, per tale azione è in grado di ripristinare l'eccitabilità nei casi di demielinizzazione paranodale quando questa è ristretta ad uno a due segmenti. Questo effetto di recupero dell'eccitabilità non è possibile per uno spinalizzato poiché il blocco dell'eccitabilità deriva da sia da demielinizzazione completa (apoptosi dell'oligodendrocita) sia da ingresso massiccio di sodio non prevenibile con 4-AP. Il massiccio ingresso di sodio è la tipica conseguenza di un'ischemia a livello della sostanza bianca. Le ragioni dello sviluppo clinico della 4-AP derivano tipicamente dalle modalità operativa delle industrie biotecnologiche americane che basano il successo nella raccolta dei fondi sull'andamento della quotazione dei loro titoli. Come descritto a monte le lesioni spinali scatenano una serie di eventi complessi e concatenati tra di loro che portano alla paralisi permanente, è quindi molto improbabile che un intervento terapeutico basato su un singolo farmaco possa bloccare od almeno contenere un processo così complesso e che si amplifica nel temo. È quindi necessario che gli interventi terapeutici vengano iniziati entro poche ore dall'evento traumatico e che impieghino una serie di farmaci atti a bloccare in più punti l'amplificazione del processo che porta alla paralisi permanente. Un esempio dell'utilità della politerapia ci viene insegnato dall'attuale terapia dell'infarto cardiaco, che si avvale ora di vari farmaci che aggrediscono aspetti diversi dei processi scatenati dall'occlusione coronarica.
OBBIETTIVI SCIENTIFICI
1. Individuazione di una terapia che sia una buona rappresentazione delle conoscenze attuali
2. Contenimento del danno nella fase acuta che segue alla lesione spinale.
a-Studio dei meccanismi implicati nella fase acuta della lesione spinale
b-Individuazione dei principi attivi da utilizzare nel trattamento della fase acuta della lesione spinale e dei fenomeni apoptotici
c-Recupero dell'eccitabilità degli assonale a livello del sito di lesione
3. Studio sulla promozione della rigenerazione nervosa dopo la lesione spinale.
a-Individuazione di trattamenti farmacologici o chirurgici (trapianti) per ridurre la formazione della cicatrice a livello della lesione
b-Individuazione di principi attivi per la promozione della rigenerazione nervosa
c-Individuazione delle migliori strategie per il trapianto di cellule staminali.
PROTOCOLLO SPERIMENTALE
Il protocollo sperimentale si riferisce esclusivamente alla componente preclinica del progetto.
Lesione traumatica del midollo spinale
Il sistema classico di lesione spinale ideato da Allen per produrre una lesione traumatica del midollo spinale da contusione con peso da 10 o 20 grammi a caduta libera da un'altezza di 10 o 20 cm è stato recentemente rivisto e modificato con la costruzione del cosiddetto "NYU impactor". Nel nostro laboratorio abbiamo utilizzato le informazioni rese disponibili attraverso internet ed in collaborazione con la facoltà di Ingegneria del Politecnico abbiamo costruito l' "UTS Impactor", il cui progetto sarà disponibile a tutti gli interessati. Il maggiore vantaggio del nostro sistema rispetto all' NYU Impactor è l'eliminazione dell'influenza della gravità attraverso un sistema ottico che per mezzo di un sistema a feed-back negativo regola il campo magnetico in cui è immerso il percussore eliminando così la variante provocata dalla gravità. L'intera procedura operativa viene attuata e controllata attraverso un PC, per cui è possibile decidere con precisione l'intensità della forza di impatto (variabile in centesimi di Newton) e la sua durata (da 0,1 a 60 sec), che vengono registrate per mezzo di un apparato piezoelettrico.
La lesione traumatica del midollo spinale verrà effettuata in ratti del peso di 220-240 grammi, che successivamente verranno ospitati in gabbie singole con lettiera altamente assorbente. Solo ratti che nei test comportamentali precedenti la lesione risulteranno normali potranno entrare nello studio.
La lesione spinale viene effettuata in ratti anestetizzati con pentobarbital (50 mg/kg) con laminectomia effettuata a livello T8 e con esposizione della dura madre per un diametro di circa 3 mm. La colonna viene stabilizzata a livello dei processi T7 e T9, poi il percussore viene centrato sul sito di laminectomia, abbassato fino ad 1 mm dalla dura madre e verrà effettuata la lesione. Verrà utilizzata la lesione determinata da 1 Newton di forza, che analizzata secondo la BBB locomotor scale provoca un deficit motorio molto significativo seguito da un lento recupero che può arrivare al 50%.
I test comportamentali verranno effettuati prima della lesione spinale, 24 ore dopo e due volte la settimana per 4 settimane. La sperimentazione viene terminata a questo punto perché il recupero è ormai stabilizzato.
Valutazione del recupero motorio. Verrà seguita la scala a 21 punti di Basso, Beattie e Bresnahan (BBB)
Test del nuoto. Il ratto viene posto al centro di una piscina rotonda piena d'acqua della dimensione di 40 cm di diametro e profonda 30 cm. La nostra esperienza ha fornito 3 gradi di valutazione:
0 - Nessun arto posteriore viene usato per nuotare e per uscire
1 - Uso parziale degli arti posteriori
2 - Uso normale degli arti posteriori
Il recupero spontaneo massimo è 1,2.
Valutazione morfologica della lesione. Al termine delle sessioni comportamentali, il sito di lesione verrà analizzato morfologicamente per determinarne la dimensione. Mentre i tronconi di midollo sopra e sotto la lesione verranno sezionati e immunocolorati per la 5-HT. Poiché gli assoni contenenti 5-HT provengono dai nuclei del Raphe e vengono interrotti al sito di lesione, l'intensità della loro colorazione a monte e soprattutto a valle della lesione stessa è indicativa dell'effetto protettivo delle strategie terapeutiche in uso. In caso di positività di risposta verrà utilizzato un sistema di analisi dell'immagine per quantificare il fenomeno. Questo verrà accoppiato all'analisi dei livelli di 5-HT e del suo catabolita 5-HIAA misurati per mezzo della cromatografia liquida ad alta risoluzione (HPLC), che serviranno a determinarne il loro turnover e sintesi indicativi dell'attività neurochimica sopra e sotto la lesione.
Apoptosi. Osservazioni effettuate nel nostro laboratorio ed in altri hanno dimostrato che i primi giorni susseguenti alla lesione sono i più critici e che l'entità del recupero dipende da come questo processo prende piede in questi primi giorni. Una buona fase iniziale prelude ad un buon recupero. Questa fase estremamente complessa è caratterizzata dall'apoptosi, un processo di morte cellulare non di tipo walleriano, che si manifesta nella maniera più grave tra i giorni 3 e 7 dopo la lesione. I bersagli di particolare importanza sono gli oligodendrociti, la loro scomparsa porta ad una minore mielinizzazione degli assoni sopravvissuti e alla perdita irreversibile della loro eccitabilità. Questo potrebbe essere uno dei processi alla base del blocco della conduzione dell'impulso nervoso alla periferia del sito di lesione. La limitazione farmacologica del processo apoptotico rappresenta un obbiettivo primario. L'apoptosi viene determinata per immunocitochimica valutando la colorazione con l'annexina V, per colorazione TDT o per analisi della rottura del DNA.
Sistemi in vitro e Apoptosi
Un'analisi dettagliata di eventuali effetti neuroprotettivi verrà effettuata in vitro utilizzando cellule in coltura in cui il processo apoptotico viene attivato per sottrazione di un fattore neurotrofico vitale come NGF per neuroni sensoriali e PC12, o per sottrazione del siero fetale di vitello come nel caso del neuroblastoma SY5Y, delle PC12 o delle HL60.I principi attivi in esame da soli o associati ad altri in proporzioni opportune verranno aggiunti ai terreni di coltura a vari dosaggi per determinare un eventuale effetto di dose risposta. L'osservazione degli effetti sulla mortalità o sopravvivenza cellulare sarà accompagnata dall'osservazione dei livelli di aumento del calcio intracellulare, delle attività proteasiche tipiche dell'apoptosi e della frammentazione del DNA, inoltre verrà misurata la produzione dei ROS ( radicali liberi, prodotti dell'ossigeno estremamente reattivi) .
La mortalità o la sopravvivenza cellulare si valuano con il metodo del MTT (fluorescente) o con la colorazione dei nuclei con il Hoechst 33258. L'analisi dei ROS si fa sfruttando dei fluorocromi come la diidrorodamina e leggendo poi allo spettrofluorimetro. La frammentazione del DNA si valuta con fluorometria all'etidio bromuro dopo separazione del DNA frammentato.
Bersagli Molecolari
Molti processi intracellulari sono implicati nella morte cellulare determinata dall'apoptosi, come prima fase determineremo l'attività di JNK e di p38 mitogen activated protein kinases (MAP) nella direzione pro-apoptotica, mentre per l'attività antiapoptotica verrano studiate due altre vie intracellulari estremamente efficaci come la fosfatidilinositolo-3 chinasi (PI-3K), che blocca le proteasi apoptotiche, e la FAK (focal adhesion kinase) che viene attivata dall'interazione della cellula con la matrice extracellulare. Dati preliminari suggeriscono che sia FAK che PI-3K vengano attivate nell'attività antiapoptotica di importanti principi attivi come FAK e glucosaminoglicani.
Rigenerazione nervosa e formazione della cicatrice gliale.
La formazione della cicatrice gliale in seguito a lesione da taglio o traumatica in genere è riconosciuta sin dai tempi di Santiago Ramon Y Cayal, che la descrisse come la causa della rigenerazione abortiva nel SNC, come l'ostacolo principale alla rigenerazione nervosa nel midollo spinale leso. Il progetto innovativo sulla rigenerazione nel midollo spinale leso si basa quindi su due approcci fondamentali:
1. la promozione della rigenerazione nervosa
2. il superamento dell'ostacolo costituito dalla cicatrice gliale
Questi due punti possono essere affrontati simultaneamente o singolarmente a seconda dei modelli sperimentali che si utilizzano.
1. La rigenerazione nervosa e la sua promozione farmacologica vengono studiate con gradualità. Il principio attivo con potenzialità neurorigenerative viene impiegato in vari modelli sperimentali atti a provare la sua efficacia:
· Rigenerazione delle vie serotoninergiche dopo lesione selettiva con 5,7-DHT. Queste vie originano da nuclei del raphe e proiettano lungo tutto il midollo spinale facendo un grande numero di ramificazione. La loro rigenerazione, discreta ma lenta (circa 8-10 settimane), costituisce un buon test di prima efficacia.
· Rigenerazione delle vie serotoninergiche dopo emisezione del midollo. Si valuta come il trattamento sia in grado di stimolare l'aggiramento della lesione da parte di queste vie.
· Prevenzione delle degenerazione retrograda in seguito ad assotomia. Verrà lesionata la via rubro-spinale e valutata la sopravvivenza dei neuroni del nucleo rosso, oppure verranno assotomizzati i motoneuroni e la loro sopravvivenza verrà valutata per mezzo del trasporto retrogrado di traccianti iniettati nei monconi a valle della lesione o nelle zone bersaglio.
· Sviluppo di trapianti cellulari. In questi anni grande enfasi è stata data al trapianto di neuroni fetali per contenere i deficit prodotti dal morbo di Parkinson ed Alzheimer dopo vari anni e tentativi il progetto è ancora inconcluso per svariati motivi Nella nostra ipotesi di lavoro invece non si tratta di sostituire neuroni morti con quelli fetali, ma piuttosto di creare dei ponti attraverso i quali gli assoni spinali possano crescere ed attraversare od aggirare il sito di lesione. Questo potrebbe essere permesso dall'uso di cellule staminali di origine neurogena o della cute degli stessi animali che vengono poi lesionati, questo potrebbe portare alla riformazione della mielina con grande efficacia ed al recupero di un certo numero dei neuroni persi con la lesione traumatica.
TRATTAMENTI FARMACOLOGICI
I trattamenti farmacologici rappresentano la novità nella terapia spinale poiché i principi attivi proposti sono frutto della nostra ricerca e così anche la modalità d'uso. I nostri recenti risultati hanno mostrato che l'attività neuroprotettiva dell'IGF-I (insulin-like growth factor) diminuisce drasticamente dopo un certo periodo di somministrazione (3-4 settimane), questo viene determinato dall'aumento dei livelli ematici delle sue proteine leganti (IGFBPs). Se invece IGF-I viene co-somministrato con eparina od eparan solfato, che scalzano IGF-I dalle IGFBPs, l'attività neuroprotettiva di IGF-I non diminuisce nel tempo. Questa modalità di trattamento ha portato all'arresto della malattia dei motoneuroni nei topi wobbler o Mnd, suggerendo un grandissimo potenziale terapeutico per questa combinazione. Inoltre il dermatan solfato ha una certa attività antitrombotica, che potrebbe essere utile nel contrastare l'ischemia post-traumatica nel midollo. Questa combinazione di farmaci rappresenta attualmente il più potente trattamento neuroprotettivo disponibile. Vengono quindi proposti i seguenti gruppi di trattamento :
· IGF-I a varie dosi
· GAGs a varie dosi
· dermatan solfato a varie dosi
· cotrattamento GAGs-IGF-I
· cotrattamento dermatan solfato-IGF-I
· cotrattamento dermatan solfato-IGF-I + antiossidante
· cotrattamento GAGs-IGF-I + antiossidante
Un'altra terapia sperimentale è quella con eritropoietina ad alte dosi, che alcuni studi recenti suggeriscono sia in grado di contenere la reazione infiammatoria e la degenerazione retrograda post-traumatica cerebrale. La somministrazione i.p. del farmaco verrà effettuata per i primi 7 giorni dopo la lesione ed alle dosi di 50, 500 e 5000 unità/kg.
In uno studio le cellule staminali verranno iniettate nel midollo spinale alla periferia della lesione, mentre in un altro per via epidurale e intraventricolare
Ass. A. Santa Maria O.N.L.U.S
V.le Piemonte,70
21053 Castellanza (VA)
Tel. 0331-393.214.-393.206